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      劉東波論文(GLP1R-GFP穩定轉染 Rin-m5F 細胞系的構建)

      發布時間: 2021-01-11 | 作者:新誠智慧藥房

      GLP1R-GFP穩定轉染 Rin-m5F 細胞系的構建


      胡涌泉 1,2 ,曾璐漫 2,6 ,吳艷陽 2,5 ,魏云林 7 ,劉東波 1,2,3,4*


      (1. 湖南農業大學園藝園林學院,長沙 410128;2. 國家中醫藥管理局亞健康干預技術實驗室,長沙 410128;3. 湖南省作物種質創新與資源利用重點實驗室,長沙 410128;4.湖南省植物功能成分利用協同創新中心,長沙410128;5. 湖南農業大學食品科學技術學院,長沙 410128;6. 湖南應用技術學院,湖南 常德415100;7. 昆明理工大學生命科學與技術學院,昆明 650500)摘要:目的 本研究目的是構建一種能穩定表達綠色熒光蛋白(GFP)人胰高血糖素樣肽 -1 受體(GLP1R)的胰島細胞系,用來篩選 GLP1R 激動劑類藥物。方法 使用 X-tremeGENE HP DNATransfection Reagent將 pCMV6-AC-GLP1R-GFP 質粒轉染到 Rin-m5F細胞,經 G418 篩選單克隆 Rin-m5F/GLP1R-GFP 細胞并擴大培養。結果 該細胞能穩定傳代,熒光顯微鏡下觀察細胞綠色熒光分布均勻,Western blot驗證 GLP1R 蛋白表達顯著增加。在實驗驗證中,對照空白組中細胞綠色熒光分布均勻,陰性藥物格列本脲(非 GLP1R 靶點藥物)作用時細胞內無明顯熒光斑點出現,陽性藥物百泌達作用(GLP1R 激動劑類藥物)時細胞內出現顯著熒光斑點。結論 GLP1R 激動劑類藥物篩選模型 Rin-m5F/GLP1R-GFP 成功構建。該模型能對混合物樣品進行篩選,具有假陽性極低、篩選所需樣本小、篩選樣品量大、易標準化、篩選速度快、特異性強等優勢,為 GLP1R 激動劑類藥物的篩選奠定了基礎。


      關鍵詞:人胰高血糖素樣肽 -1 受體;Rin-m5F;質粒轉染


      中圖分類號:R739.4    文獻標識碼:A    文章編號: 1672-2981(2017)06-0785-05doi:10.7539/j.issn.1672-2981.2017.06.018Construction of GLP1R-GFP stably transfection Rin-m5F cell linesHU Yong-quan 1, 2 , ZENG Lu-man 2, 6 , WU Yan-yang 2, 5 , WEI Yun-lin 7 , LIU Dong-bo 1, 2, 3, 4* (1. Horticulture andLandscape College, Hunan Agricultural University, Changsha 410128; 2.State Key Laboratory of SubhealthIntervention Technology, Changsha410128; 3. Hunan Key Laboratory of Crop Germplasm Innovation andUtilization, Hunan Agricultural University, Changsha 410128; 4. Hunan Co-Innovation Center forUtilizationof Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128; 5. College of Food Science and Technology, HunanAgricultural University, Changsha 410128; 6. Hunan College of Applied Technology, Changde Hunan 415100;7. Faculty of Life Sciences and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500)Abstract: Objective To establish a new method to screen glucagon like peptide-1 receptor (GLP1R) agonists.Methods The pCMV6-AC-GLP1R-GFP plasmid was transfected into Rin-m5F cells byX-tremeGENE HPDNA transfection reagent. Monoclonal Rin-m5F/GLP1R-GFP cells were screened by G418. The fluorescencespots were observed by fluorescence microscope. GLP1R expression was de tected by Western blot. ResultsThese cells were passaged normally with stable green fluorescence, and the expression of GLP1R protein wassignificantly increased. The green fluorescence of the control group was dispersive, and the Glibenclamide


      (non GLP1R target drugs) treatment group did not show distinct fluorescence spots, while the Byetta (GLP1Ragonists) treatment group showed lots of fluorescence spots (activation of GLP1R). Conclusion Rin-m5F/GL-P1R-GFP, the model for GLP1R agonist screening, has been successfully constructed. This model is rapid and基金項目:國際科技合作與交流專項(No.2013DFG32060)。


      作者簡介:胡涌泉,男,在讀碩士研究生,主要從事細胞生物學、分子營養研究,E-mail:bookhulai@sina.cn  * 通訊作者:劉東波,男,教授,博士研究生導師,主要從事亞健康干預基礎和應用技術研究,Tel:(073184617244,E-mail:chinasaga@163.com786Central South Pharmacy. June 2017, Vol. 15 No.6 中南藥學 2017 年 6 月 第 15 卷 第 6 期糖尿病是由遺傳因素、病毒感染、自由基毒素、細胞因子等各種致病因子作用于機體導致胰島功能減退,肝臟、骨骼肌、脂肪組織等發生胰島素抵抗進而引發的一系列代謝紊亂綜合征[1-4] 。臨床上以高血糖(空腹血糖> 7.0 mmol·L- 1 ,餐后血糖> 11.1mmol·L- 1 )為主要特點 [5] 。糖尿病患者組織器官長期處于高血糖狀態會引發諸多并發癥,導致心腦血管、肝、腎眼、足等部位的衰竭病變,且無法治愈[6-8] 。胰 高 血 糖 素 樣 肽 1(GLP1) 因 與 GLP1 受 體(GLP1R)結合后可刺激胰島素分泌并抑制胰高血糖素分泌,已成為近些年糖尿病藥物開發的重要靶點[9] 。已有的 GLPlR 激動劑類藥物均屬于大分子多肽類,不能口服給藥,長期服用會產生諸多不良反應,且保存與運輸條件要求嚴苛[10-11] 。因此需要尋找不良反應少且療效長期穩定的 GLP1R 小分子激動劑藥物。目前基于 GLPlR 為靶點構建的高通量 GLP1 激動劑篩選模型主要從受體與配體結合、檢測胞內第二信使 cAMP、構建受體功能反應報告基因三個方面進行[12] 。但這些篩選模式假陽性高、篩選時間長、篩選效低,嚴重制約了 GLP1 類似物小分子藥物的開發。因此建立篩選 GLPlR 激動劑模的研究變得尤為迫切。本文研究目的是建立一種新的 GLPlR 激動劑類藥物篩選方法:構建穩定表達綠色熒光蛋白人 GLP1R 細胞模型 Rin-m5F/GLP1R-GFP并通過陽性藥物百泌達、陰性藥物格列本脲驗證該模型應用于 GLPlR 激動劑類物篩選的效果。


      1 材料


      1.1 細胞


      株大鼠胰島素瘤細胞株(Rin-m5F)(上海通派生物科技有限公司)。


      1.2 試藥


      pCMV6-AC-GLP1R-GFP 質粒(湖南農業大學劉東波教授惠贈),RMPI 1640 培養基(Gibco),胎牛血清(BI),谷氨酰胺(TransGen),0.25%EDTA- 胰酶(TransGen),X-tremeGENE HP DNA TransfectionReagent(Roche)G418(Sigma),防熒光淬滅封片劑(Southern Biotech),多聚甲醛(Sigma),GLP1R抗體(Abcam),GAPDH 抗體(Yataihengxin),羊抗小鼠 IgG1 二抗(Southern Biotech),羊抗兔 IgG1 二抗,一次性過濾器(Millex),一次性注射器(上海治宇),圓形蓋玻片、載玻片(世泰),細胞培養板(Corning)等。


      1.3 儀器


      CO 2 恒溫細胞培養箱(美國 SHELLAB),倒置顯


      微鏡(上海荼明光學 BXP-106),倒置熒光顯微鏡(日本 OLYMPUS),激光共聚焦熒光顯微鏡(Zeiss LSM710),超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司,SW-CJ-IFD),Countess 自動細胞計數儀(Life Technologies),電子天平(型號 JL3003,JENNER),超純水儀(Milli-RO Plus,millipore)等。


      2、方法


      2.1 細胞培養


      細胞復蘇后置于 25 cm 2 培養瓶中,在 37℃,5%CO 2 條件下培養,具體方法見參考文獻[13] 。


      2.2 轉染及其體系優化


      ① 取對數生長期 Rin-m5F細胞消化成單個的細


      胞懸液,均勻接種于 6 孔板中,設置細胞密度分別為2×10 5 、4×10 5 個·mL- 1 ,CO2 培養箱過夜培養;


      ②根據轉染試劑說明書上推薦的使用濃度制備轉染溶液,質粒(μg)∶轉染試劑(μL)分別為 1∶2、1∶3、1∶4。取 2.5 μg pCMV6-AC-GLP1R-GFP 質 粒 溶 于 97 μL無血清 RMPI 1640 培養基中,輕輕來回混勻,室溫靜置5 min,使質粒與培養基充分混勻;再按照比例相應加入轉染試劑,輕輕來回混勻,室溫靜置 40 min,使混合物充分混勻;


      ③ 棄掉 6 孔板中的培養基,用 PBS 洗2 遍,每孔加入 2 mL新鮮完全培養基;


      ④ 在轉染組逐滴加入轉染溶液,邊加邊晃動 6 孔板,使轉染液與細胞培養基充分混勻。


      ⑤ 標記好空白組及對照組,將細胞放入 CO 2 細胞培養箱中,37℃、5%CO 2 培養24 h;


      ⑥倒置熒光顯微鏡下觀察,隨機選取視野并拍照。運用軟件 Image-Pro-Plus 6.0 統計細胞數目,計算轉染效率;


      ⑦ 去掉轉染溶液,PBS 洗 2 遍,加入新鮮完全培養基恢復培養 2 d,備用。


      2.3 優化 G418 篩選濃度


      ① 取對數生長期 Rin-m5F細胞消化成單個的細胞懸液,均勻接種于 24 孔板中,過夜培養。


      ② PBS 洗2 遍,更換新鮮培養基,按下面濃度加入 G418 溶液:1000、600、200、100、50、0 μg·mL -1 。


      ③ 按照步驟②中 G418 濃度梯度,每 2 日更換 1 次新鮮培養基(含 G418),連續培養觀察 14 d。若孔內細胞大量死亡,則該孔 G418 減半篩選;若孔內細胞已全部死亡,則該孔停止加入 G418 溶液。每日在倒置顯微鏡下觀察細胞死亡情況。


      ④ 將“2.2”項下恢復培養 2 d 后轉染組的細胞,加入 1 mg·mL -1 G418 溶液培養 2 d,PBS 洗 2 遍,更換新鮮培養基繼續培養,每日觀察細胞生長情況。


      2.4 篩選單克隆細胞株


      ① 按照“2.2”項下最佳轉染體系轉染細胞,24 hefficient for screening GLP1R agonists, owint to its advantage of admixture-screening, high throughput, lowfalse positive rate, fewer samples needed and ease of application comparing to the traditional screening model.Key words: glucagon like peptide-1 receptor; Rin-m5F; plasmid transfection787


      中南藥學 2017 年 6 月 第 15 卷 第 6 期 Central South Pharmacy. June 2017, Vol. 15 No.6后去轉染液,PBS 洗 2 遍,更新 2 mL新鮮培養基,37℃、5%CO 2 恢復培養 2 d。


      ② 加入 G418,篩選轉染細胞。按“2.3”項下篩選得到的 G418 濃度,先選用使細胞大量死亡的濃度,然后更換小濃度 G418 繼續篩選。


      ③ 每日在倒置熒光顯微鏡下觀察,當轉染組中未被轉染的細胞全部被殺死,則停止 G418 篩選。


      ④PBS 洗 2 遍,更換新鮮培養基,37℃、5%CO 2 培養,至綠色熒光細胞出現單克隆團細胞。期間根據培養基顏色及細胞狀態及時更換新鮮完全培養基。


      ⑤ 采用梯度稀釋法篩選單克隆細胞株:將轉染組中孔內的細胞用胰酶消化,棄掉胰酶,加入 1 mL新鮮完全培養基將細胞吹打成單個的細胞懸液。按照 10 倍稀釋法,將細胞加入 96 孔板中依次進行稀釋,直至孔內細胞濃度為 1 ~ 2 個每 100 μL。


      ⑥ 每日置于倒置熒光顯微鏡下觀察,根據實際情況為細胞更換新鮮完全培養基。


      ⑦當 96 孔板內細胞密度達到 30%時,消化細胞移入 24孔內擴大培養。


      ⑧ 當 24 孔板內細胞密度達到 80%以上時,消化細胞移入 T-25 細胞培養瓶中擴大培養。


      ⑨凍存細胞,備用。


      2.5 Western blot檢驗


      在 6 孔板內分別接種相同數目的 Rin-m5F野生型細胞和步驟“2.4”項下獲得的Rin-m5F/GLP1R-GFP單克隆細胞株,在完全培養液中培養至細胞密度長至90%左右。PBS 洗 2 遍,每孔加 200 μL2%SDS 裂解液,收取蛋白樣品。置于 100℃水浴 10 min,加入 40μL的 6× 上樣 Buffer稀釋,置于 100℃水浴 10 min。Western blot實驗方法見參考文獻[14] 。


      2.6 模型驗證


      實驗分為空白對照(完全培養基)、溶劑對照(培養基加入 1%PBS、1%酒精、1%DMSO)、陽性對照(GLP1R 靶點藥劑,百泌達)、陰性對照(非 GLP1R靶點藥劑,格列本脲)。不同濃度藥物處理相同時間:濃度設置為 0.25、0.5、2.5、5 μg·mL- 1 ,均處理 1 h。相同濃度藥物處理不同時間:藥物濃度為 0.25μg·mL- 1 ,分別處理 10、20、40、120 min。


      操作流程:


      ① 將無菌圓形玻片在酒精燈火焰上來回灼燒數次,冷卻后平鋪在 24 孔板內,每孔一片;


      ②取“2.4”項下獲得的單克隆細胞 Rin-m5F/GLP1R-GFP接種于圓形玻片上,輕輕搖晃培養板,使細胞均勻分布在板內,過夜至細胞密度長至 85%以上;


      ③ PBS 洗2 遍,加入含不同濃度藥物的培養基 37℃孵育不同時間;


      ④ 吸棄培養液,PBS 洗 3 遍。加入 500 μL 4%多聚甲醛固定細胞 10 min,吸棄,PBS 洗 3 遍;


      ⑤ 取潔凈載玻片,滴加 20 μL防熒光淬滅粘片劑,用鑷子輕輕夾起圓形玻片,輕輕倒扣在防熒光淬滅粘片劑上,防止氣泡產生;


      ⑥ 將玻片置于暗室通風干燥過夜,制好的玻片于激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察并拍照。


      2.7 數據統計與分析


      采用 SPSS 17.0 軟件進行統計學分析。數據以均數 ± 標準差(x±s)表示,組間采用單因素方差分析,各組均數都采用 LSD(Least-significant differencetest)檢測,若 P < 0.05 為差異有統計學意義。


      3、結果


      3.1 細胞形態觀察


      細胞 Rin-m5F復蘇時在顯微鏡下觀察,細胞基本呈單個、圓形均勻分布在新鮮完全培養基內,細胞密度為 50%左右,培養基中無明顯雜質。過夜培養后,細胞貼壁率為 90%以上,細胞輪廓清晰、多呈不規則形狀分布,多呈島狀聚集鋪開生長。經胰酶消化,顯微鏡下觀察顯示細胞逐漸變圓,細胞間開始出現間隙。吹打成單個以 1∶3 傳代至 3 代時,細胞形態正常、生長速率恢復到最佳,每 2 ~ 3 日即可傳代(見圖 1)。


      1.png


      圖 1 Rin-m5F細胞顯微鏡觀察圖(200×)


      Fig 1 Micro-observation of Rin-m5F cell lines(200×)


      3.2 轉染及其體系優化


      轉染時在細胞接種量、質?!棉D染試劑 2 個方面進行優化,轉染 24 h 后,倒置熒光顯微鏡下觀察轉染成功的細胞整個分布綠色熒光、熒光強度不一。拍照、統計轉染效率分別見表 1。


      表 1 轉染效率Tab 1 Transfection efficiency


      2.png


      3.3 選擇合適的 G418 篩選濃度


      加入各濃度 G418 培養細胞,每日在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態。觀察得到 10 ~ 14 d 最低濃度至全部細胞死亡的 G418 濃度為 100 μg·mL -1 。但是Rin-m5F細胞在 G418 作用 48 h 后,濃度 1 mg·mL -1組的細胞基本全部死亡。Rin-m5F細胞轉染組在 1788Central South Pharmacy. June 2017, Vol. 15No.6 中南藥學 2017 年 6 月 第 15 卷 第 6 期mg·mL -1 G418 中培養 48 h 后,未轉染的細胞大量死亡,轉染成功帶綠色熒光的細胞形態無顯著變化,繼續培養,帶綠色熒光的細胞開始分裂增殖(見圖 2)。


      3.png


      圖 2 熒光顯微鏡細胞觀察圖(scale bar= 100 μm)


      Fig 2 Fluorescence microscope-observation ofcells(scale bar = 100μm)


      3.4 篩選單克隆細胞株


      Rin-m5F細胞孵育轉染溶液 24 h、更換新鮮完全培養基恢復培養 24 h、1 mg·mL -1 濃度的 G418 篩選培養 2 d 后,倒置熒光顯微鏡下觀察未被轉染的細胞基本全部死亡。降低 G418 濃度至 100 μg·mL -1 ,每3 日更換 1 次新鮮完全培養基,成功轉染的細胞擴大培養 12 d,按照 10 倍稀釋法消化細胞接種于 96 孔板,選取熒光強、分布均勻的單克隆細胞并擴大培養,倒置熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡下觀察、拍照,結果見圖 3。


      4.jpg


      圖 3 Rin-m5F/ GLP1RGFP 單 克 隆 細 胞 觀 察 圖(scale bar= 200μm、10 μm)


      Fig 3 Observation ofRin-m5F/ GLP1R-GFP monoclonal cells(scalebar= 200 μm、10 μm)


      3.5 蛋白印記鑒定


      以 Rin-m5F為空白對照,53 KD 處轉染后獲得的單克隆細胞株 Rin-m5F/GLP1R- GFP 中 GLP1R 表達量增加,結果見圖 4。結果表明:GLP1R 已成功轉染,并在單克隆細胞中穩定表達。


      5.png


      圖 4 GLP1R 的表達


      Fig 4 Expression of GLP1R


      3.6 模型驗證


      單克隆細胞株 Rin-m5F/GLP1R-GFP 在不同條件下孵育,收樣、制片,置于激光共聚焦下觀察并拍照,結果見圖 5 ~ 6。如圖所見,溶劑對照組中細胞綠色熒光均勻分布,陰性對照組(非 GLPlR 靶點藥物)中無明顯熒光斑點,陽性對照組(GLPlR 激動劑藥物)中細胞內出現明顯的熒光斑點。


      6.jpg


      圖 5 不同濃度藥物處理細胞 1 h 結果(scale bar= 10 μm)Fig 5 Cells treated with different concentrations of drugs for 1 h(scalebar= 10 μm)


      7.jpg


      圖 6 相同濃度藥物處理細胞不同時間結果(scale bar= 10 μm)


      Fig 6 Confocal fluorescence microscopy of cells(scale bar= 10 μm)


      結果表明:綠色熒光標記的 GLPlR已經成功整合到 Rin-m5F中,并穩定表達。非 GLPlR靶點藥物格列本脲處理組細胞內無明顯熒光斑點,未能激活模型;GLPlR激動劑藥物百泌達處理組細胞內綠色熒光明顯聚集成熒光斑點,激活模型。因此該模型建立成功,能用于篩選 GLPlR激動劑類藥物。


      4、討論


      目前大部分以 GLPlR為靶點構建的高通量激動劑篩選模型的設計原理是根據 GLPlR信號途徑的特點來設計,主要可以分為以下 3 個方面[15] :① 基于受體與配體結合原理構建模型:熒光微體積測定技術、熒光偏振法;② 基于檢測胞內第二信使 cAMP構建模型:競爭性酶聯免疫吸附檢測法、閃爍鄰近測定法、載黑色素細胞測定法;③ 基于受體功能反應構建報告基因構建模型:陳家琪等[16]在 CHO細胞中穩定轉染帶有增強型789中南藥學 2017 年 6 月 第 15 卷 第6 期 Central South Pharmacy. June 2017, Vol. 15 No.6綠色熒光蛋白(EGFP)報告基因和 GLP1R,殷菲等[17]利用 GLPlR和報告基因在 PC12 細胞中建立穩定的GLPlR激動劑篩選模型。這 3 個方面設計的篩選模型各有特色,受體——配體結合分析檢測方法缺點是成本高且不能識別是配體是激動還是拮抗劑;檢測 cAMP的篩選模型要求裂解細胞釋放出胞內的 cAMP,且還需洗滌除去未結合的標記 cAMP;報告基因篩選模型常需要作用底物或者輔助因子,篩選成本高。本實驗中選用 Rin-m5F作為宿主細胞是基于GLPlR 激動劑類藥物治療糖尿病的主要作用靶點位于胰島細胞上,這樣筆者的篩選模型能更加貼切反應藥物治療糖尿病時的生理機能。采用直接標記 GLPlR C端,使靶蛋白可視化,通過觀察胞內熒光變化就能直觀反應受體被激活,具有極大降低假陽性的優勢。高內涵篩選平臺是近年發展起來的新的篩選模式,通過采集熒光圖像,綜合運用高分辨率的熒光數碼影像技術、數理統計分析方法等模板在單一實驗中反應被測樣品的生物活性、藥代動力學性質和潛在毒性等。該篩選技術的優勢在于所有的檢測能在活細胞內進行,篩選速度快。本文建立的基于熒光標記使靶向蛋白可視化的原理,使該模型符合高內涵篩選平臺的基本要求,為篩選 GLPlR 激動劑的高通量篩選奠定了堅實的基礎。該模型能應用于混合物樣品 GLP1 類似物小分子藥物的篩選,具有假陽性極低、篩選所需樣本小、篩選樣品量大、易標準化、篩選速度快、特異性強等優勢。同時這種研究模式為我國中藥分子機制提供新的思路,為我國中藥實現復方創新、早期評價、早期淘汰等目標提供便捷。參考文獻[1] 中華醫學會糖尿病學分會 . 中國 2 型糖尿病防治指南(2007 年版)[J]. 中華醫學雜志,2008,88(18):1227-1245.[2] LiuD,Darville M,Eizirik DL. Double-stranded ribonu-cleic acid(RNA)induces beta-cell Fas messenger RNAexpression and increases cytokine-induced beta-cell apopto-sis [J]. Endocrinology,2001,142(6):2593-2599.[3] Liu D,Pavlovic D,Chen MC,et al. Cytokines induceapoptosis in beta-cells isolated from mice lacking the induc-ible isoform of nitric oxide synthase(iNOS-/-)[J]. Diabe-tes,2000,49(7):1116-1122.[4] Muoio DM,Newgard CB. Mechanisms of disease:Mo-lecular and metabolic mechanisms of insulin resistance andbeta-cell failure in type 2 diabetes [J]. Nat Rev Mol CellBiol,2008,9(3):193-205.[5] 錢榮立 . 關于糖尿病的新診斷標準與分型[J]. 中國糖尿病雜志,2000,8(1):5-6.[6] 姚君厘,楊永年 . 糖尿病并發癥感染及其危險因素分析[J]. 中華醫院感染學雜志,1998,8(4):216-218.[7] Bahtiyar G,Gutterman D,Lebovitz H. Heart failure:amajor cardiovascular complication of diabetes mellitus [J].Current Diabetes Reports,2016,16(11):116-130.[8] Bril F,Cusi K. Nonalcoholic fatty liver disease:The newcomplication of type 2 diabetes mellitus [J]. Endocrinol Me-tab Clin North Am,2016,45(4):765-781.[9] Bo AE. Islet G protein-coupled receptors as potential targetsfor treatment of type 2 diabetes [J]. Nature Reviews DrugDiscovery,2009,8(5):369-385.[10] 閆榮,楊子義 . 胰高血糖素樣肽 -1 類似物新藥的研發進展[J]. 中國生物制品學雜志,2011,24(7):866-868.[11] 毛黎靜,安春紅,張貝娜,等 . 新型糖尿病治療藥物的研究進展[J]. 中南藥學,2017,15(1):88-91.[12] 盛靈通,孔建龍,秦健,等 . GLP-1 及其類似物治療糖尿病的研究進展[J]. 糖尿病新世界,2015,(2):22-23.[13] Lai X,Kang X,Zeng L,et al. The protective effectsand genetic pathways of thorn grape seeds oil against highglucose-induced apoptosis in pancreatic β -cells [J]. BMCComplem Altern M,2014,14(1):10-17.[14] Wu Y,Wang X,Guo H,et al. Synthesis and screeningof 3-MA derivatives for autophagy inhibitors. [J]. Autopha-gy,2013,9(4):595-603.[15] 許芳芳,王楠,李剛強,等 . 人胰高血糖素樣肽 -1 的研究與應用進展[J]. 生物技術通報,2016,32(6):30-37.[16] 陳家琪,高智慧,朱元元,等 . 重組胰高血糖素樣肽 -1與人血清白蛋白融合蛋白的純及活性研究[J]. 微生物學通報,2007,34(5):871-874.[17] 殷菲,鄧小紅,景佳佳,等 . 胰高血糖素樣肽 1 受體激動的高通量篩選及作用機制研究[J]. 中國藥學雜志,2007,42(1):24-27.


      (收稿日期:2017-02-20;修回日期:2017-05-01)


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