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      劉東波論文(H 2 O 2 誘導胰島 RIN - m5F細胞構建氧化應激模型)

      發布時間: 2021-01-12 | 作者:劉東坡

      H 2 O 2 誘導胰島 RIN - m5F細胞構建氧化應激模型

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      摘要:探討 H 2 O 2 誘導胰島 β - 細胞氧化應激模型建立。以不同濃度 H 2 O 2 作用于胰島 RIN - m5F細胞株12 ,18 , 24h探索氧化應激模型;顯微鏡觀察細胞誘導后的形態學變化;采用活性氧( ROS)試劑盒 DCFH - DA 探針檢測細胞內活性氧含量; Hochst染色后利用熒光顯微鏡觀察 H2O2誘導后的細胞凋亡情況。結果表明:隨著 H 2 O 2 濃度升高,細胞團塊減少,崩解增多,細胞數目呈現減少的趨勢, ROS含量依次升高,細胞凋亡率增加;隨著誘導時間的加長, ROS含量顯著增加( P<0.01 )。 250 μ mol / L?。?2 O 2 誘導18h是構建氧化應激模型的最佳條件。關鍵詞: H 2 O 2 ;氧化應激;胰島 β- 細胞

      Abstract : To?。椋睿觯澹螅簦椋纾幔簦濉。簦瑁濉。铮穑簦椋恚幔臁。悖铮睿洌椋簦椋铮睿蟆。妫铮颉。铮椋洌幔簦椋觯濉。螅簦颍澹螅?/span>

      model?。悖铮睿螅簦颍酰悖簦椋铮睢。椋睿洌酰悖澹洹。猓?H 2 O 2 in?。穑幔睿悖颍澹幔簦椋?β - cell.RIN - m5F

      cell?。鳎幔蟆。澹穑铮螅澹洹。椋睢。?2 O 2 with?。洌椋妫妫澹颍澹睿簟。悖铮睿悖澹睿簦颍幔簦椋铮睿蟆。妫铮颉。保玻?, 18h ,

      24hto?。悖铮睿螅簦颍酰悖簟。铮椋洌幔簦椋觯濉。螅簦颍澹螅蟆。恚铮洌澹欤停铮颍穑瑁铮欤铮纾?change?。鳎幔蟆。铮?-

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      250 μ mol / L?。幔妫簦澹颉。椋睿悖酰猓幔簦椋铮睢。铮妗。保福瑁?/span>

      Keywords : H 2 O 2 ; oxidative?。螅簦颍澹螅?; pancreatic β - cell

      近年來,越來越多的臨床和基礎研究 [1 , 2 ] 表明,糖尿病及其并發癥的發生與氧化應激密切相關。氧化應激是指機體在遭受刺激后,體內活性氧類物質( reactive?。铮纾澹睢。螅穑澹悖椋澹?,ROS )產生過多,如活性氧自由基,超出自身的清除能力,致氧化和抗氧化狀態失衡,造成氧化損傷 [3 ] 。與其它組織細胞相比,胰島 β 細胞由于自身自由基清除酶和 ROS清除蛋白含量較低,在 長 期 高 血 糖 的 誘 導 下 更 易 引 起 氧 化 應 激 反應 [4 ] 。由于糖基化作用、葡萄糖氧化和多元醇等作用導致活

      性氧 ROS的產生,胰島 β 細胞功能損傷甚至細胞凋亡,從而使葡萄糖刺激的胰島素分泌減少,誘導糖尿病的發生 [5-7 ] 。此外, ROS 還參與一些其它的生物效應,包括細胞的生長、遷移,炎性細胞的表達,基質成分的調控等等,從而導致糖尿病慢性并發癥 [8 , 9 ] 。過氧化氫( H 2 O 2 )是一種重要的活性氧物質,它不僅容易發生均裂形成一種活性極強的活性氧自由基———羥自由基( OH ),而且極易透過細胞膜,與細胞內鐵離子通過 Fenton 反應形成高活性的自由基。同時, H 2 O 2 方便易得、性質穩定,已成為研究細胞氧化損傷的重要工具 [10 , 11 ] 。鄭延松等 [12 ] 用低濃度過氧化氫(100 μ mol / L )成功建立了心肌細胞氧化損傷模型, Ankur?。停幔瑁澹螅瑁鳎幔颍?等 [13 ] 通過H 2 O 2 體外誘導睪丸精細胞凋亡模型研究其作用途徑, F.Warleta 等 [14 ] 研究還發現角鯊烯對 H 2 O 2 誘導的人類乳腺上皮細胞 MCF10ADAN 損傷具有保護作用。但 目 前 為 止,基 于 胰 島 β 細 胞RIN - m5F 細胞株的氧化應激模型尚未報道。胰島素瘤是起源于胰島 β 細胞最常見的一種胰腺內分泌腫瘤,其不依賴血糖變化而分泌和釋放過量的胰島素,因此近年來常用作胰島β 細胞的體外模型進行糖尿病的機理研究。本研究擬通過不0 4同 H2 O 2 濃度誘導胰島 β 細胞 RIN - m5F細胞株不同的時間,觀察其細胞形態,檢測其活性氧水平,細胞凋亡數目,建立體外氧化應激模型,為續抗糖尿病的藥物篩選及藥理評估提供依據。


      1  材料與方法

      1.1  試驗材料

      1.1.1  細胞株

      大鼠胰島素瘤細胞株 RIN - m5F :派通(上海)生物科技有

      限公司。

      1.1.2  主要試劑耗材與儀器胰蛋白酶( Trypsin ):≥3?。埃埃埃?/mg,德國Sigma公司;活性氧( ROS )測試盒:南京建成生物工程研究所;胎牛血清、 RPMI- 1640培養基:美國 Hyclone公司;6孔細胞板、 96孔細胞板、培養瓶:美國康寧公司;精密電子天平: PL403型,瑞士 Mettler?。裕铮欤澹洌锕?;移液槍:lh - 212型,德國 Eppendorf公司;CO 2 恒溫細胞培養箱: 2424 - 2 型,美國 Shellab 公司;細胞計數儀: Countess 型,美國 Invitrogen 公司;全波長多功能酶標儀: THERMO?。停酰欤簦椋螅耄幔睢。疲欤幔螅?型,芬蘭 Labsystems 公司;熒光倒置顯微鏡:IX71 型,日本 Olympus 公司。1.2  試驗方法

      1.2.1  細胞培養  RIN - m5F 細胞株復蘇后用含 15% 胎牛血清的 RPMI1640 培養基轉入培養瓶中,于 37℃ 、 5% CO 2 、具有飽和濕度的 CO 2 培養箱中培養。次日經 5% 胰酶消化后,更換含 13% 胎牛血清的 RPMI1640 培養基以 1∶3 的比例進行傳代培養, 4 代后的對數期細胞用于以下試驗。


      1.2.2  細胞分組   取第 4 代后對數期生長細胞,消化后按1×106 個細胞/孔接種于 6 孔板或 1×10 4 個細胞/孔接種于96 孔板(細胞密度由細胞懸液加入胎盼藍于細胞計數儀直接讀?。?,貼壁培養。細胞分組:

      ( 1 )空白對照組:13% 胎牛血清的 RPMI1640 培養基;

      ( 2 )對照組( A ): 13% 胎牛血清的 RPI1640 培養基 +定量等體積 DMSO ;

      ( 3 )模型對照組( B ): 13% 胎牛血清的 RPMI1640 培養基 +100 μ mol / L 活性氧供氫體(試劑盒提供) + 定量等體積DMSO ,作為構建模型的陽性對照;

      ( 4 )模型組1 ( C1 ): 13%胎牛血清的 RPMI1640培養基+100 μ mol / L?。?2 O 2 +定量等體積 DMSO ;

      ( 5 )模型組 2 ( C2 ): 13% 胎牛血清的 RPMI1640 培養基+175 μ mol / L?。?2 O 2 + 定量等體積 DMSO ;

      ( 6 )模型組 3 ( C3 ): 13% 胎牛血清的 RPMI1640 培養基+250 μ mol / L?。?2 O2 +定量等體積 DMSO ;

      ( 7 )模型組 4 ( C4 ): 13% 胎牛血清的 RPMI1640 培養基+325 μ mol / L?。?2 O 2 + 定量等體積 DMSO ;

      每組在分別培養 12 , 18 , 24h 后進行后續試驗(分別標記為-1, -2 , -3 ),每一時間點3個重復。 DMSO的加入,用來消除后續研究藥物溶解帶來的系統誤差。


      1.2.3  細胞形態學觀察   置顯微鏡10×目鏡,10×物鏡下觀察結果及拍照。


      1.2.4  活性氧檢測 參照試劑盒說明書,取各處理組細胞,吸棄培養基, PBS沖洗2次后,加入10 μ mol / L的DCFH - DA探針工作液。黑暗中37℃孵育1h ,使用全波長多功能酶標儀上機檢測,其中激發波長488nm ,發射波長525nm 。


      1.2.5  熒 光 顯 微 鏡 觀 察 細 胞 凋 亡   將 Hochst?。常常常矗?/span>( 1mg / mL ,pH?。罚?/span>)加入培養的 RIN - m5F細胞中至終濃度10 μ g / mL ,避光37 ℃孵育30min ; 100 μ g / mL 多聚賴氨酸和PBS以1∶9的比例混合,包被細胞5min 。在熒光顯微鏡10×目鏡, 10×物鏡下觀察,熒光顯微鏡激發濾片選用紫外光( UV)激發濾片,阻斷濾片為460nm 。1.2.6  數據統計試驗結果使用 Excel?。玻埃埃澈停樱校樱印。保梗?/span>軟件進行統計學方差分析,所得數據以平均數±標準差表示。各組均數均采用 LSD ( Least - significant?。洌椋妫妫澹颍澹睿悖濉。簦澹螅?),其中 P<0.05 為顯著差異有統計學意義, P<0.01 為極顯著差異。


      2  結果與分析

      2.1  細胞形態與細胞數目觀察

      顯微鏡觀察細胞形態結果顯示:正常胰島 β 細胞呈單層貼壁生長,細胞間有連接并部分融合成島狀,細胞邊緣清晰,呈多邊不規則形,分布均勻,生長良好。模型對照組,加入活性氧供氫體后,細胞貼壁性能變差,重疊處減少,散狀分布增多。而經 H 2 O 2 誘導后的胰島 β 細胞,細胞間連接明顯減少,細胞呈鈍圓,少觸角;但模型組各梯度、各時間段的形態,由肉眼觀察無法鑒定是否具顯著性差異。同時,據圖 1 觀察可知,模型組與模型對照組的細胞密度均小于對照組。


      2.2?。?2 O 2 誘導的 RIN - m5F 細胞 ROS 檢測DCFH - DA ( 2 ’, 7 ’ - dichlorofluorescein?。洌椋幔悖澹幔簦?)是迄今最常用、最靈敏的細胞內活性氧檢測探針, DCFH - DA 本身沒有熒光,進入細胞后被酯酶水解為 DCFH ( dichlorofluo -rescein ),當活性氧存在時 DCFH 被氧化為不能透過細胞膜

      的強綠色熒光物質 DCF ( dichlorofluorescein )被熒光酶標儀檢測。由表 1 可知,對照組與空白對照組相比,無論時間長短, ROS含量均有所上升,但不具有統計學差異;而與對照組相比,模型對照組 ROS含量極顯著上升( P<0.01 ),模型組3、4 ( 250 , 325 μ mol / L?。?2 O 2 )不同的處理時間組其ROS含量均極顯著上升( P<0.01 )。當 H 2 O2 處理時間為 12h ,模型組 3 、 4 ( 250 , 325 μ mol / L?。?2 O 2 )其 ROS 含量極 顯 著 上 升( P<0.01 );而各濃度處理 24h 后,雖均具有極顯著差異,ROS含量上升( P<0.01 ),但是隨著處理濃度逐漸增加至325 μ mol / L 時,其 ROS 含量卻有下降的趨勢。當 H 2 O 2 誘導時間為 18h ,各模型組間表現出差異性,除模型組 1 外,其余組 ROS 含量均顯著上升,誘導濃度 175 μ mol / L 具有顯著性。

      圖片

      圖 1  不同處理組胰島 RIN - m5F 細胞株形態學的觀察

      Figure?。薄。停铮颍穑瑁铮欤铮纾?of?。穑幔睿悖颍澹幔簦椋恪。遥桑?- m5Fcelllines?。椋睢。洌椋妫妫澹颍澹睿簟。簦颍澹幔簦恚澹睿?/span>表 1?。?2 O 2 對 RIN - m5F 細胞 ROS 含量的影響 Table?。薄。牛妫妫澹悖簟。铮妗。?2 O 2 on?。遥希印。悖铮睿簦澹睿簦椋睢。遥桑?- m5Fcell ( n =3 )

      圖片

      差異( P<0.05 ),濃度為 250 ,325 μ mol / L 時具極顯著差異性( P<0.01 )。


      2.3  熒光顯微鏡觀察細胞凋亡

      Hochst?。常常常矗?可被細胞攝取,與 DNA 結合在紫外光下

      呈藍色熒光。在熒光顯微鏡下,活細胞核呈彌散、微弱、均勻熒光,壞死細胞不被 Hochst染色,凋亡細胞由于對 Hochst攝取增強,其細胞核或細胞質內可見濃染致密的顆粒狀熒光(藍色)及明顯核形態變化 [15 ] 。本試驗中,對照組呈現彌散、微弱的藍斑; H 2 O 2 誘導RIN - m5F細胞株,隨著 H2 O 2 濃度的增加其細胞可見濃染致密的藍色斑點數目增加,即細胞凋亡的數量大幅增加,且趨勢呈劑量依賴性(圖 2 )。

      圖片

      圖 2?。?2 O 2 誘導胰島 RIN - m5F 細胞株 Hochst 染

      色后熒光顯微鏡的觀察(誘導 18h )

      Figure?。病。?2 O 2- induced?。穑幔睿悖颍澹幔簦椋恪。遥桑?- m5Fcell

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      3  討論

      氧化應激誘導產生的過量 ROS 不僅可以直接損傷胰島β 細胞,還可以通過影響胰島素合成和分泌的信號轉導通路間接損傷胰島 β 細胞 [16 ] 。因此探討胰島 β 細胞氧化應激模型對糖尿病的研究具有重要意義。


      本試驗采用 H 2 O 2 誘導胰島 β 細胞建立氧化應激模型。由顯微鏡觀察結果可知, H 2 O 2 誘導后胰島 β 細胞形態呈現凋亡狀態,且與正常對照組細胞相比,細胞數目明顯減少,說明 H 2 O 2 可較好地誘導構建氧化應激模型;但各 H 2 O 2 誘導濃度與誘導時間點其細胞形態與細胞數目,由肉眼觀察無法鑒定是否具顯著性差異,因此本研究進行了 H 2 O 2 誘導后的活性氧檢測。


      在所有時 間 處 理 組 中,模 型 組 3 、 4 ( 250 , 325 μ mol / LH 2 O 2 )的 ROS含量均極顯著上升( P<0.01 ),但仔細觀察發現, 325 μ mol / L?。?/span>2 O 2 誘導 24h 后活性氧含量減少,呈下降趨勢。這可能是由于過量的 H 2 O 2 導致了細胞的大量凋亡,從而使 ROS含量的測量值降低。本模型的構建是為了方便后期抗糖尿病藥物的抗氧化性研究,因此,本研究構建的氧化應激模型的理想狀態是,細胞 DNA 被外泄、損傷,細胞內的脂質、蛋白質也被破壞,這種損傷可能會導致細胞凋亡,但

      在適宜的抗氧化劑的作 用 下,卻又 有 可 能 被 修 復。因 此,250 μ mol / L?。?2 O 2 可作為氧化應激的最佳濃度,此濃度可較好地誘導胰島 RIN - m5F細胞損傷( P<0.01 ),卻又避免了濃度過高導致的細胞不可逆損傷。由于250 μ mol / L?。?2 O 2 各誘導時間處理組( 12 ,18 , 24h )其 ROS含量均大幅上升( P<0.01 ),考慮到12h的 ROS測量數值較小且試驗時間不易安排, 24h誘導時間過長,也有可能會導致過度損傷,因此本試驗選定18h作為最佳誘導時間。在獲得了構建氧化應激模型的最佳誘導濃度250 μ mol / LH 2 O 2 和誘導時間18h后,本試驗還采取 Hochst?。常常常矗矡晒馊?/span>色觀察細胞凋亡狀來驗證本氧化應激模型。由圖2可知,隨著 H 2 O 2 濃 度 增 加,細 胞 凋 亡 數 量 呈 上 升 趨 勢,濃 度 達325 μ mol / L時,細胞大量凋亡。從而可知, 250 μ mol / L?。?2 O 2誘導胰島 RIN - m5F細胞18h可較好的構建氧化應激模型。目前,已有文獻報道 H 2 O 2 誘導構建的多種細胞氧化應激 [17 ] ,其選擇 H2 O 2 誘導濃度各異, 1 μ mol/ L 至4mmol / L不等 [18 ] ,而 誘 導 時 間 也 各 不 相 同,自

      10 min 至 24h 不等 [19-21 ] 。葉春 玲 等 [ 22 ] 以500 μ mol / L?。?2 O 2 作 用 于 胰 島RIN - m β 細胞 6h 建立凋亡模型,與本試驗所得結果相近。而張健等 [21 ] 構建血管內皮細胞的氧化應激損傷模型只采用了 1 μ mol / L?。?2 O 2 培養 4h ,庹勤慧等 [23 ] 卻利用高濃度 H2 O 2( 1mmol / L )誘導 24h 構建血管內皮細胞凋亡模型。這可能是由于所誘導的細胞/細胞株系、細胞的培養條件、試驗的環境以及試驗目的各不相同。氧化應激與糖尿病的發生密切相關,合適的細胞模型對體外評價對其發病機制及抗糖尿病的藥物作用機理研究有著重要的指導意義。該模型的建立為揭示糖尿病氧化應激機制以及研究和篩選抗氧化藥物和功能食品奠定了基礎。參考文獻

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