<noframes id="qflft"></noframes>
    <b id="qflft"></b>
    <s id="qflft"></s>

      <kbd id="qflft"></kbd>
      <rp id="qflft"><code id="qflft"></code></rp>

    1. 當前的位置: 首頁> 新聞資訊> 劉東波論文(穩定表達 RFP-GFP-LC3 的大鼠胰島 β 細胞株的 構建)

      新聞詳情

      返回新聞列表

      劉東波論文(穩定表達 RFP-GFP-LC3 的大鼠胰島 β 細胞株的 構建)

      發布時間: 2021-01-12 | 作者:劉東坡

      穩定表達 RFP-GFP-LC3 的大鼠胰島 β 細胞株的構建

      周佳麗 1, 3 , 吳艷陽 2 , 羅玉霜 1, 3 , 袁玉菊 2 , 劉明俊 6 , 劉東波 1, 3, 4, 5*


      1. 湖南農業大學 園藝園林學院, 中國湖南 長沙 410128; 

      2. 湖南農業大學 食品科學技術學院, 中國湖南 長沙 410128;

      3. 國家中醫藥管理局亞健康干預技術實驗室, 中國湖南 長沙 410128; 4. 湖南省作物種質創新與資源利用重點實驗室,

      中國湖南 長沙 410128; 5. 湖南省植物功能成分利用協同創新中心, 中國湖南 長沙 410128; 6. 湖南省馬王堆醫院,中國湖南 長沙 410128


      摘 要 : 為了簡便自噬相關機理藥物在胰島 β 細胞上的高通量篩選 , 實驗通過慢病毒轉染技術 , 將 RFP-GFP-LC3質粒轉入大鼠胰島 β 細胞株 (RIN-m5f), 用 G418 對感染細胞進行篩選 , 激光共聚焦進行活細胞拍攝驗證 , 得到100% 表達 RFP-GFP-LC3 質粒的細胞株。 無血清饑餓處理細胞 , 結果顯示 : 饑餓組GFP/RFP 熒光點比值較對照組下降 , P62 蛋白表達量以及 S6K 磷酸化水平降低 , 加入 10 μmol/L 氯喹部分抑制自噬后 , GFP/RFP 熒光點比值回升。 以上結果表明穩定表達 RFP-GFP-LC3 的 RIN-m5f 構建成功 , 并能夠以簡單的檢測方式準確表達自噬全過程 , 為自噬在糖尿病藥物機理方面的研究奠定了基礎。

      關鍵詞 : 糖尿病 ; 自噬 ; 慢病毒轉染 ; RIN-m5f 細胞株

      中圖分類號 : Q291 文獻標識碼: A     文章編號 : 1007-7847(2019)02-0087-05


      糖尿病是一種全球性的、以持續高血糖癥為特征的代謝紊亂疾病。血糖異常升高的原因可能是胰島素自身分泌缺陷(1 型糖尿病, T1D), 或肝臟等效應器官產生胰島素抵抗, 或胰島素分泌不足(2 型糖尿病, T2D) 

      [1] 。在 T1D 和 T2D 的情況下, 持續高濃度的葡萄糖會引起細胞內抗氧化能力的失衡, 導致亞硝基介導的氧化應激和損傷。氧化和糖化蛋白的積累是糖尿病相關的常見蛋白質修飾, 其部分原因可能是自噬缺陷

       [2] 。因此, 越來越多的研究認為相關細胞自噬可能有利于糖尿病的治療。β 細胞是人體內唯一能夠分泌胰島素的功能細胞, 研究 β 細胞的自噬對于糖尿病的治療與控制具有重大意義。相關研究報道, β 細胞自噬可通過調控胰島素顆粒的降解來影響細胞胰島素的釋放 [3~4] 。自噬是真核細胞內一種高度保守的再循環過程, 它通過降解細胞質中的細胞器、蛋白質和大分子物質, 對分解產物進行再利用。自噬在細胞存活和功能維持中起著重要作用 [5] 。細胞自噬由多個步驟組成, 其中包括: 

      1) 吞噬泡的形成;

       2) 自噬體的形成;

       3) 自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體;

       4) 自噬溶酶體的降解 [6] 。自噬流是這些步驟在細胞內連續出現的動態過程, 自噬流的活化或受阻往往會形成不同的生物學效應 [7] 。人們在研究過程中逐漸發現, 自噬流受阻可能誘發多種疾病 [7] 。微管相關蛋白輕鏈 3 (microtubule-associatedprotein light chain 3, LC3)是自噬體膜標志物, 一般散在分布于細胞質 [8] 。在自噬過程中, 胞質形式的LC3 (LC3-Ⅰ)與磷脂酰乙醇胺結合形成 LC3-磷脂酰乙醇胺結合物(LC3-Ⅱ) [9] 。紅色熒光點-綠色熒光點-LC3 (red fluorescence point-green fluores-cence point-LC3, RFP-GFP-LC3)融合蛋白是一種方便的自噬熒光蛋白標記物。在自噬發生初期,

      胞漿型 LC3 轉變為膜型 LC3, 在熒光顯微鏡下可觀察到紅色/綠色共定位的點狀聚集。自噬后期,溶酶體與自噬體融合形成自噬溶酶體, 細胞環境pH 發生變化。當環境 pH<5 時, GFP 熒光敏感發生淬滅, 只能檢測到紅色熒光點狀聚集 [10] 。因此可以通過 GFP 熒光點與 RFP 熒光點比例來評價自噬流進程。目前可通過瞬時轉染的方法檢測自噬流, 通過在細胞中瞬時高表達 RFP-GFP-LC3 質粒來進

      行后續實驗 [11] , 但是瞬時轉染的方法具有穩定性差、轉染效率低等缺點。為解決這一問題, 我們通過慢病毒轉染的方法構建了能夠穩定表達 RFP-GFP-LC3 質粒的大鼠胰島 β 細胞株, 這將有利于研究自噬在胰島 β 細胞中的作用, 同時也可將其用于治療糖尿病藥物的初步篩選。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      慢病毒包裝系統(該病毒系統包括 VSVG 質粒、Δ8.9 質粒); 293FT 細胞、RIN-m5f 細胞株(湖南農業大學亞健康實驗室凍存); DH5α 感受態細胞(北京全式金生物技術有限公司)。DMEM 培養基、1640 培養基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(Biological Industries 公司, 以色列); Trypsin-ED-TA 細胞消化液(北京全式金生物技術有限公司);Lipofectamine TM 3000 轉染試劑(Thermo 公司, 美國);

      G418 試劑(Sigma 公司, 美國); 防熒光淬滅封片劑(SouthernBiotech 公司, 美國); SQSTM1/P62 (seques-tosome 1)抗體、S6K (ribosomal protein S6 kinase)抗體、phospho-S6K 抗體(CST 公司, 美國); GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)抗體[亞太恒信生物科技(北京)有限公司]; 6× loading

      buffer (北京全式金生物技術有限公司)。激光共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM710); 倒置熒光顯微鏡(LeicaDMI8)。

      1.2 慢病毒載體構建

      慢病毒載體構建由上海吉凱基因科技有限公司完成, 構建過程主要參照文獻[12]的方法, 簡要概述如下: 用 PCR 從 PCMV-RFP-GFP-LC3 質粒中擴增 RFP-GFP-LC3 片段; 擴增產物 10 g/L 瓊脂轉化, 篩選出重組質粒, 得到 RFP-GFP-LC3-GV374 質粒。經過測序比對確認慢病毒載體構建成功(圖1), 提取重組質粒, 純化溶解, -20 ℃保存。

      1.3 慢病毒的包裝制備

      用含有 10% FBS 的 DMEM 基礎培養基于37 ℃、5% CO 2 培養箱中培養 293FT 細胞, 細胞狀態良好。待細胞匯合至 90%左右, 將其用含0.25%of autophagy related to diabetic medicines.Key words: diabetes; autophagy; lentivirus transfection; RIN-m5f cells(Life Science Research,2019,23(2):087~091)88第 2 期 周佳麗等:穩定表達 RFP-GFP-LC3 的大鼠胰島 β 細胞株的構建。

      圖片

      圖 1 LC3 自噬流檢測慢病毒載體圖譜

      Fig.1 The vector of lentivirus for detecting LC3


      EDTA 的胰酶消化, 種入 6 孔板中, 培養 24 h。待細胞匯合度達 50%左右時, 進行換液處理并按照轉染試劑 Lipofectamine TM 3000 的說明書進行操作。即將 VSVG 質粒、Δ8.9 質粒、RFP-GFP-LC3質粒進行質量濃度 1︰1︰1 的共轉染, 轉染完成后將細胞置于 37 ℃、5% CO 2 培養箱中繼續培養24 h。到達時間后, 于倒置熒光顯微鏡下觀察轉染效率, 并收集細胞上清液, 3 000 r/min 離心 10 min,去除殘余的 293FT 細胞雜質, 即得到已包裝好RFP-GFP-LC3 質粒的慢病毒顆粒。

      1.4 穩定細胞株的篩選

      轉染前一天, 將 RIN-m5f 用 0.25% EDTA 胰酶進行消化, 種入 6 孔板中。用含 10% FBS 的1640 培養基培養 24 h 后, 將收集的慢病毒顆粒加入細胞培養液中, 對細胞進行換液處理。24 h后, 在倒置熒光顯微鏡下觀察轉染情況, 并更換新的培養基。感染約 48 h 后, 加入嘌呤霉素進行篩選培養。預實驗提示 RIN-m5f 細胞的嘌呤霉素最佳篩選質量濃度為 6 μg/mL。篩選培養約 7 d后, 未經感染的對照組細胞全部死亡, 感染組有陽性克隆細胞生長, 熒光顯微鏡下可見 RFP 熒光

      與 GFP 熒光。用 0.25% EDTA 胰蛋白酶消化陽性克隆細胞, 轉移到新的培養皿中繼續培養 2 d, 隨后收集感染病毒的穩定細胞株, 用細胞免疫熒光的方法檢測 RFP-GFP-LC3 的表達。

      1.5 自噬的誘導及自噬流的檢測

      構建成功的細胞以 1×10 5 的數目種入 24 孔板中, 37 ℃、5% CO 2 條件下培養過夜。待細胞匯合至 70%左右, 對照組使用含 10% FBS 的 1640培養基繼續培養, 饑餓組加入無血清 1640 培養基饑餓 2 h, 在饑餓+氯喹(chloroquine, CQ)組, 使用 10 μmol/L 的氯喹與饑餓共處理 2 h。到達預定處理時間后, 用 PBS 清洗兩遍, 將玻片夾出反向固定于載玻片上, 于激光共聚焦下拍攝 RFP-GFP-LC3 熒光點。

      1.6 Western-blot 分析

      構建成功的細胞以 1×10 5 的數目種入 24 孔板中, 37 ℃、5% CO 2 條件下培養過夜。待細胞匯合至 95%左右, 加入無血清 1640 培養基饑餓處理 2 h, 在饑餓+CQ 組, 使用 10 μmol/L 的氯喹與饑餓共處理 2 h。到達預定時間后, 用 PBS 洗滌細胞, 每孔加入 200 μL 2% SDS 細胞裂解液, 迅速將細胞刮下收集。每管加入 40 μL 的 6× loadingbuffer, 煮至蛋白質變性, 蛋白質可置于-20 ℃冰箱保存備用。12% SDS-PAGE 電泳后, 電轉移至PVDF 膜上, 封閉液室溫封閉 1 h, 按照 1︰1 000的稀釋比例, 分別孵育 P62、S6K、P-S6K、GAPDH一抗, 4 ℃過夜, 加入對應二抗稀釋液(1︰5 000),室溫孵育 1 h, ECL 發光顯影。

      1.7 統計學處理

      所有數據用平均值±標準差(x±s)表示。多組間比較采用單因素方差分析; 顯著性水平為 P<0.05。


      2 結果

      2.1 穩定細胞系的篩選

      慢病毒轉染 48 h 后, 用嘌呤霉素對已轉染細胞株進行篩選。大約 7 d 后, 經過篩選的細胞如圖2所示, 在熒光顯微鏡下觀察到 100% 表達紅色/綠色熒光, 表明穩定表達 RFP-GFP-LC3 的大鼠胰島細胞已經建立成功。

      2.2 自噬的誘導以及自噬流的檢測

      如圖 3A 所示, 在本實驗中可明顯觀察到對照組中自噬體較少且紅色熒光與綠色熒光的表達量一致。經過饑餓自噬誘導以后, 自噬點顯著增加, 細胞中綠色熒光點的表達量顯著低于紅色熒光的表達量。該現象是由于饑餓誘導形成了自噬流, 自噬體與溶酶體結合形成自噬溶酶體, 在自噬溶酶體的酸性環境下, 綠色熒光點發生淬滅。在對細胞進行饑餓處理的同時加入 10 μmol/L 的CQ, 發現綠色熒光的表達量較饑餓組略有回升。這是因為自噬阻斷劑 CQ 部分阻斷了自噬體與溶

      酶體的結合, 從而導致綠色熒光表達量的上升。單個細胞中紅綠熒光點的比值在各組間具有統計學差異(圖 3B)。圖片

      圖 3 激光共聚焦下觀察 RFP-GFP-LC3 穩定細胞株中自噬體的形成

      (A) 2 h 血清饑餓后 , RFP-GFP-LC3 穩定細胞株中自噬體的形成圖 ( 標尺 50 μm); (B) 圖 A 中綠色熒光點 / 紅色熒光點的統計結果。 **: P<0.01, 與對照組相比 ; #: P<0.05,與饑餓組相比。

      Fig.3 Observation of autophagy formation in RFP-GFP-LC3 stable cell line under laser scanning microscopy(A) The formation of autophagosomes in RFP-GFP-LC3 stable cell line after serum starvation for 2 h (scale bar 50 μm); (B)The cells were treated as described in (A) and the statistical results of green/red fluorescence points were analysed by SPSS 10.0software. **: P<0.01 vs. control group; #: P<0.05 vs. starvation group.

      圖 2 RIN-m5f 細胞的熒光顯微鏡觀察圖(100×)

      (A) 透射光下的 RIN-m5f 細胞株 ; (B) 綠色熒光下的 RIN-m5f 細胞株 ; (C) 紅色熒光下的 RIN-m5f 細胞株。

      Fig.2 The RIN-m5f cells observed by fluorescence microscopy (100×)

      (A) Transmitted light image; (B) Green fluorescence image; (C) Red fluorescence image.

      2.3 自噬誘導后相關蛋白質的表達分析細胞經過無血清饑餓處理 2 h 后用 2% SDS溶液裂解, 收集總蛋白質, 采用 Western-blot 的方法檢測自噬相關蛋白質 P62 及 S6K 的表達水平。結果如圖 4 所示, 自噬底物 P62 蛋白的水平下降,與此同時 m-TOR 活性評價蛋白質 S6K 的磷酸化水平下降, 由此證明自噬流被成功誘導, 與圖 3結果所示一致。

      圖片

      3 討論

      近年來, 越來越多的證據表明, 自噬是一種治療糖尿病的新靶點, 具有多種有益作用。同時許多藥物和天然產物通過多種信號途徑參與自噬調節, 包括誘導或抑制自噬 [13] 。有實驗研究表明傳統中藥消渴平可通過誘導自噬抑制小鼠胰島細胞

      在高糖培養下的細胞凋亡 [14] , 這對于糖尿病的研究具有重大意義, 同時也提示自噬的精準檢測愈發重要。目前, 通過細胞免疫熒光技術以及 West-ern-blot 對 LC3-Ⅰ和 LC3-Ⅱ的檢測, 并不能完整地反映自噬的整體過程。本實驗通過慢病毒轉染的方法, 將已融合的紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白與 LC3 蛋白轉入 RIN-m5f 細胞, 這樣能夠在較為簡單的共聚焦活細胞拍攝下, 清楚觀察到細胞自噬的整個過程, 實驗簡便易行。


      雙熒光 RFP-GFP-LC3 體系是比 GFP-LC3更全面可靠的自噬定量分析方法。該體系最大的優點是不需要外加其他藥物干預, 可以同時直觀地判斷細胞自噬活性和自噬流(自噬通量)的變化 [15~16] 。在本研究中, 我們運用慢病毒轉染的方法, 成功構建了表達 RFP-GFP-LC3 的大鼠胰島 β 細胞株,并通過 G418 進行篩選, 運用激光共聚焦拍攝手段進行檢測, 發現細胞最終能 100%表達 RFP-GFP-LC3 質粒。在此基礎上, 根據 RFP 與 GFP 對pH 的不同適應度 [17~18] , 通過無血清饑餓誘導細胞自噬, 結果顯示: 在饑餓條件下, 綠色熒光點因溶酶體環境 pH 較低發生淬滅, 而紅色熒光點穩定存在, 因此 GFP/RFP 熒光點的比值下降; 當加入

      10 μmol/L 氯喹部分阻斷自噬流后, LC3 無法與溶酶體融合, 綠色熒光點數回升。這一實驗現象符合饑餓誘導的自噬情況 [19] 。自噬是一個動態的過程,該雙色熒光體系能夠準確地同時顯示和區分自噬體和自噬溶酶體, 是檢測自噬流的最佳方法 [20] 。目前, 雙熒光 RFP-GFP-LC3 已經逐漸得到許多學者的認可, 在自噬相關研究中發揮了重要作用 [21~23] 。本實驗中, 穩定表達 RFP-GFP-LC3 質粒的大鼠胰島細胞株的成功構建不僅解決了傳統自噬檢測手段—— — 細胞免疫熒光技術需要相應一抗/二抗的孵育、實驗成本較大、步驟繁瑣耗時的缺點 [24] ,而且為自噬在糖尿病的相關研究提供了細胞平臺, 有利于自噬相關機理藥物在胰島 β 細胞上的高通量篩選, 為糖尿病藥物的開發提供了便利。參考文獻(References):[1] WANG P, FIASCHI-TAESCH N M, VASAVADA R C, et al. Di-abetes mellitus-advances and challenges in human β-cell prolif-eration[J]. Nature Reviews Endocrinology, 2015, 11(4): 201-212.[2] PRIYADARSHINI M, WICKSTEED B, SCHILTZ G E, et al. SC-FA receptors in pancreatic beta cells: novel diabetes targets?[J].Trends in Endocrinology & Metabolism, 2016, 27(9): 653-664.[3] YAMAMOTO S, KURAMOTO K, WANG N, et al. Autophagydifferentially regulates insulin production and insulin sensitivi-

      ty[J]. Cell Reports, 2018, 23(11): 3286-3299.[4] GOGINASHVILI A, ZHANG Z, ERBS E, et al. Insulin gran-ules. Insulin secretory granules control autophagy in pancreat-ic β cells[J]. Science, 2015, 347(6224): 878-882.

      [5] PARZYCH K R, KLIONSKY D J. An overview of autophagy:morphology, mechanism, and regulation[J]. Antioxidants and Re-dox Signaling, 2013, 20(3): 460-473.[6] MEIJER A J, CODOGNO P. Autophagy: a sweet process in di-abetes[J]. Cell Metabolism, 2008, 8(4): 275-276.[7] 秦正紅, 樂衛東. 自噬: 生物學與疾病[M]. 北京: 科學出版社(QIN Zheng-hong, LE Wei-dong. Autophagy: Biology and Dis-ease[M]. Beijing: Science Press), 2011: 415-420.[8] NAKATOGAWA H, ICHIMURA Y, OHSUMI Y. Atg8, a ubiq-

      uitin-like protein required for autophagosome formation, me-diates membrane tethering and hemifusion[J]. Cell, 2007, 130(1):165-178.

      [9] KABEYA Y, MIZUSHIMAN, UENOT, et al. LC3, a mammalian

      homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome mem-

      branes after processing[J]. The EMBO Journal, 2000, 19(21):5720-5728.

      [10] KHARAZIHA P, CHIOUREAS D, BALTATZIS G, et al. So-rafenib-induced defective autophagy promotes cell death bynecroptosis[J]. Oncotarget, 2015, 6(35): 37066-37082.[11] FAN H D, CHEN S P, SUN Y X, et al. Seipin mutation at gly-cosylation sites activates autophagy in transfected cells via ab-normal large lipid droplets generation[J]. Acta Pharmacologica

      Sinica, 2015, 36(4): 497-506.[12] HU D, WU J, ZHANG R, et al. Autophagy-targeted vaccine ofLC3-LpqH DNA and its protective immunity in a murine modelof tuberculosis[J]. Vaccine, 2014, 32(20): 2308-2314.[13] ZHANG X W, ZHOU J C, HU Z W. Autophagy as a target fordevelopment of anti-diabetes drugs derived from natural compounds[J]. Journal of Asian Natural Products Research, 2017, 19(4): 314-319.[14] WU Y, HU Y, ZHOU H, et al. Xiaokeping-induced autophagyprotects pancreatic β-cells against apoptosis under high glucosestress[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2018, 105: 407-412.[15] KIMURA S, NODA T, YOSHIMORI T. Dissection of the au-tophagosome maturation process by a novel reporter protein,tandem fluorescent-tagged LC3[J]. Autophagy, 2007, 3(5): 452-460.[16] SHANWARE N P, BRAY K, ENG C H, et al. Glutamine de-privation stimulates mTOR-JNK-dependent chemokine secre-tion[J]. Nature Communications, 2014, 5: 4900.[17] MAUVEZIN C, AYALA C, BRADEN C R, et al. Assays to mon-itor autophagy in Drosophila[J]. Methods, 2014, 68(1): 134-139.[18] SINGH, OJHA S, BHATTACHARYA A, et al. Stable transfectionand continuous expression of heterologous genes in Entamoebainvadens[J]. Molecular and Biochemical Parasitology, 2012, 184(1): 9-12.[19] DEVENISH R J, PRESCOTT M. Autophagy: starvation relievestranscriptional repression of ATG genes[J]. Current Biology, 2015,25(6): R238-R240.[20] NODA N, FUYUHIKO I. Mechanisms of autophagy[J]. AnnualReview of Biophysics, 2015, 44(1): 101-122.[21] XU L, SHEN J, YU L, et al. Role of autophagy in sevoflurane-

      induced neurotoxicity in neonatal rat hippocampal cells[J]. BrainResearch Bulletin, 2018, 140: 291-298.[22] BOLTON M G, COLIVEN O M, HILTON J. Specificity of isozymesof murine hepatic glutathione S-transferase for the conjugationof glutathione with L-phenylalanine mustard[J]. Cancer Re-

      search, 1991, 51(9): 2410-2415.[23] GINET V, SPIEHKMANN A, RUMMEL C, et al. Involvement ofautophagy in hypoxic-excitotoxic neuronal death[J]. Autophagy,2014, 10(5): 846-860.[24] CLAESSENS J, BELMONDO T, LANGHE E D, et al. Solid phaseassays versus automated indirect immunofluorescence for detection of ant inuclear antibodies[J]. Autoimmunity Reviews, 2018,17(6): 533-540.


      集團公眾號

      聯系我們

      公司電話 : +400-690-1009
      湖南省長沙市岳麓西大道2450號環創企業廣場B3-B4棟

      版權所有 2016-2021 湘ICP備18009842號-1
      亚投娱乐全站官方入口